GUIDE

Läs kromatogrammet och masspektrumet, steg för steg

Axlarna, huvudtoppen, integrationstabellen och laddningarna: så läser du de två graferna bakom renhet och identitet i en analysrapport.

I korthet

BPC-157:s genomsnittliga massa

1 419,5 Da

m/z för BPC-157 med två protoner

710,8

förskjutningen när metionin oxideras

16 Da

Vad visar ett kromatogram?

Ett kromatogram visar hur mycket detektorn registrerade över tid när provet passerade genom HPLC-kolonnen: varje topp är ett ämne som kom ut vid en viss tid, och toppens area speglar hur mycket av det detektorn såg. Renhetssiffran i ett certifikat räknas fram ur de areorna.

Den här guiden är den praktiska delen: hur du läser graferna när du har dem framför dig. Vad metoderna mäter och inte mäter förklarar guiden om renhet och analys, och vad ett certifikat är för dokument står i vår genomgång av analyscertifikat.

Orden som dyker upp, som retentionstid, baslinje och m/z, finns också i ordlistan om du vill slå upp dem ett i taget.

Hur läser du integrationstabellen?

Integrationstabellen är listan under kromatogrammet där varje topp har ett nummer, en retentionstid, en area och en areaprocent; renheten är areaprocenten på huvudtoppens rad. Tabellen är alltså själva räkningen bakom certifikatets renhetssiffra, rad för rad.

Kolumnerna brukar heta ungefär Peak, RT eller Ret. Time, Area, Height och Area %. Alla areaprocent tillsammans blir 100. Står huvudtoppen på 99,2 procent utgör de övriga topparna tillsammans 0,8 procent, och det är just de siffrorna som ett certifikat sammanfattar som total förorening.

Kontrollera också vilka toppar som räknats med. Signaler i början av körningen, där lösningsmedlet passerar, räknas ofta inte, och rapporten ska då ange från vilken tid integrationen gäller. Vad ett procenttal betyder och inte betyder går artikeln om vad renhetsprocenten betyder igenom.

Topp för topp

Så går du igenom ett kromatogram och dess tabell i samma ordning varje gång.

1. Läs metoden först

   Notera kolonn, våglängd och körtid i rapportens metoddel. Utan dem går två kromatogram inte att jämföra.

2. Hitta huvudtoppen

   Den högsta toppen med störst area är normalt peptiden. Notera dess retentionstid.

3. Leta upp dess rad i tabellen

   Matcha huvudtoppens retentionstid mot tabellen och läs areaprocenten. Det är renhetssiffran.

4. Granska de små topparna

   Se var de ligger: nära huvudtoppen, tidigt eller sent i körningen. Läget ger en ledtråd om vad de är.

5. Jämför med certifikatet

   Renheten i tabellen ska vara samma tal som certifikatets sammanfattning, och batchnumret detsamma som på flaskan.

Vad betyder en axel eller en liten topp bredvid huvudtoppen?

En axel eller en liten topp tätt intill huvudtoppen betyder oftast ett ämne som liknar peptiden mycket, till exempel en variant där en aminosyra saknas eller har ändrats kemiskt. Eftersom det liknar huvudämnet lämnar det kolonnen nästan samtidigt.

En axel är en utbuktning på huvudtoppens sida i stället för en egen topp, och den betyder att två ämnen inte separerats helt. Integreras axeln ihop med huvudtoppen räknas den som peptid, och då blir renhetssiffran något högre än den hade blivit med bättre separation. En rapport där axeln är avskild med ett lodrätt streck, eller har en egen rad i tabellen, har redovisat den.

Små toppar långt från huvudtoppen är ofta ämnen av annat slag, som rester från framställningen. Deras storlek syns i tabellen: en topp på 0,1 areaprocent är en tusendel av det detektorn registrerade.

Tre saker att kontrollera i tabellen

• Summan blir 100 Alla areaprocent tillsammans ska bli 100: huvudtoppen plus föroreningarna.
• Var integrationen börjar Rapporten ska ange från vilken tid topparna räknas, så att lösningsmedlets signal inte ingår.
• Axlar och små toppar En axel med egen rad är redovisad. En axel utan rad kan ha räknats in i huvudtoppen.

Hur läser du ett masspektrum?

Ett masspektrum läses genom att leta upp de toppar vars m/z-värden motsvarar peptidens beräknade massa med en, två eller tre extra protoner; finns de där stämmer identiteten. X-axeln är m/z, massan delad med laddningen, och y-axeln är hur många joner som registrerades.

Räkningen är kort. Med z protoner är m/z lika med massan plus z gånger 1,007, delat med z. För BPC-157, med sekvensen GEPPPGKPADDAGLV och en genomsnittlig massa på 1 419,5 dalton, ger en proton en topp kring 1 420,5 och två protoner en topp kring 710,8. Båda pekar på samma molekyl.

Tabellen nedan visar de förväntade värdena för tre peptider, räknade ur sekvensen. Instrument med hög upplösning visar i stället den monoisotopiska massan, som för BPC-157 ligger knappt ett dalton lägre. Hur massan räknas fram ur sekvensen, och varför monoisotopisk och genomsnittlig massa skiljer sig, förklarar artikeln om molmassa och dalton.

Förväntade m/z-värden, räknade ur sekvensen

Genomsnittliga massor. Monoisotopiska värden ligger något lägre.

Varför kan samma peptid ge flera toppar i MS?

Samma peptid ger flera toppar i ett masspektrum eftersom molekylen kan bära olika många laddningar, förekomma med tyngre isotoper och binda andra joner än protoner. Varje sådan form har ett eget m/z-värde, men alla kommer från samma molekyl.

Laddningarna är den vanligaste förklaringen: en topp för en proton, en för två, ibland en för tre. Isotoperna syns som ett litet kluster av toppar med en enhet emellan, eller en halv enhet för en tvåladdad jon. En natriumjon i stället för en proton flyttar toppen cirka 22 enheter uppåt.

Två förskjutningar är värda att känna igen. TB-500 är N-acetylerad, och utan acetylgruppen vore massan 42 dalton lägre, kring 847. Semax innehåller metionin, som kan oxideras, och en oxiderad form syns 16 dalton över den förväntade massan.

Graferna beskriver provet, inget mer

Ett kromatogram och ett masspektrum beskriver provet som analyserades: vilka ämnen som fanns och hur stor andel huvudämnet utgjorde. De gäller den batch som testades och säger ingenting om hur en produkt ska användas.

Vad gör du när certifikatet bara visar tabellen?

Visar certifikatet siffror men inga grafer läser du resultaten på samma sätt: renheten är huvudtoppens andel, föroreningarna är resten, och identiteten ska vara bekräftad med en angiven metod. Graferna är underlaget, siffrorna är sammanfattningen av dem.

Rapporterna i vårt certifikatbibliotek sammanfattar i dag resultatet i en tabell med renhet, enskild och total förorening och uppmätt innehåll, utan att trycka själva kromatogrammet. Summan ska gå ihop: 99,2 procent renhet och 0,8 procent total förorening blir 100.

Den som vill se graferna för sin egen flaska kan beställa en egen analys; laboratorier som skickar med kromatogram och masspektrum redovisar dem i den ordning den här guiden följer. Hur ett laboratorium blev referenspunkten för köpare berättar artikeln om Janoshik. Hur du hittar rätt rapport för din flaska visar guiden om att hitta certifikatet.

Vanliga frågor om kromatogram och masspektrum

Vad metoderna mäter

Guiden om renhet och analys förklarar HPLC och masspektrometri från grunden.

Läs guiden om renhet och analys