GUIDE

Renhetssiffror och analysmetoder

Vad 99 procent faktiskt är en procent av — och vilken fråga varje metod på certifikatet svarar på.

I korthet

Exempel på huvudtoppens andel i kromatogrammet

99 %

Metoden som ger renhetens areaprocent

HPLC

Vad ett analysprov går igenom

4 moment

Två olika frågor, två olika metoder

Ett analyscertifikat besvarar två separata frågor, och de kräver olika instrument. Den första är identitet: är innehållet den molekyl som står på etiketten? Den andra är renhet: hur stor andel av innehållet utgörs av just den molekylen?

Det är lätt att blanda ihop dem, men de kan svika oberoende av varandra. En flaska kan innehålla rätt molekyl i låg renhet. Den kan också innehålla ett material av hög renhet som helt enkelt inte är den utlovade molekylen. Bara en av frågorna besvarad är därför halva svaret.

I praktiken används masspektrometri för identitetsfrågan och vätskekromatografi för renhetsfrågan. Att certifikatet redovisar båda är inte överdrivet — det är minimikravet för att uppgifterna ska gå att bedöma.

Den här sidan går in på siffrorna själva. Hur ett certifikat är uppbyggt fält för fält, och hur du matchar det mot din batch, finns samlat i certifikatbiblioteket.

Vad ett prov går igenom

Fyra moment. De två första ger renhetssiffran, de två sista identiteten.

1. Provet löses upp

   En vägd mängd av batchen löses i en bestämd volym. Allt som följer mäter relationer inom just det provet.

2. Det pressas genom kolonnen

   Under högt tryck. Kolonnens material håller kvar olika beståndsdelar olika hårt, så att de kommer ut vid olika tidpunkter.

3. Detektorn ritar toppar

   Varje beståndsdel ger en topp. Renhetssiffran är huvudtoppens yta delad med samtliga toppars yta — ren geometri, ingen bedömning.

4. Molekylen vägs

   I masspektrometern jämförs den uppmätta massan mot den sekvensen förutsäger. Det, och bara det, avgör identitetsfrågan.

HPLC: vad procenttalet mäter

HPLC står för högupplösande vätskekromatografi. Provet löses upp och pumpas genom en kolonn packad med ett material som ämnena i provet växelverkar olika starkt med. Det som binder svagt kommer ut tidigt, det som binder starkt kommer ut sent, och en detektor registrerar vad som passerar över tid.

Resultatet är ett kromatogram: en baslinje med toppar. Varje topp motsvarar ett ämne som lämnat kolonnen vid en viss tidpunkt. Huvudkomponenten ger en stor topp, föroreningar ger mindre toppar tidigare eller senare.

Renhetssiffran räknas normalt fram som areaprocent: huvudtoppens area delad med den sammanlagda arean av alla toppar. Står det 99 procent betyder det alltså att huvudtoppen utgör nittionio procent av den totala arean i kromatogrammet.

Det ordet — area — är hela nyckeln till vad siffran betyder. Den är ett relativt mått inom det som detektorn faktiskt registrerade, inte en absolut vägning av flaskans innehåll.

Vad ett renhetstal inte säger

• Säger inget om vad resten är En procent besläktade biprodukter och en procent något helt annat ger exakt samma siffra.
• Täcker bara det detektorn ser Ämnen utan UV-absorption, som restlösningsmedel och salter, ger ingen topp och räknas varken in i täljare eller nämnare.
• Säger inget om mängd En hög renhetsgrad handlar om proportioner i provet, inte om hur många milligram flaskan faktiskt innehåller.
• Gäller ett prov, ett tillfälle Certifikatet beskriver batchen som den analyserades, inte hur flaskan hanterats eller förvarats efter det tillfället.

Vad areaprocenten inte säger

Fyra begränsningar följer direkt av hur talet räknas fram, och de är värda att ha klart för sig.

Den säger ingenting om vad den återstående procenten består av. En procent besläktade syntesbiprodukter och en procent något helt annat ger samma siffra. Certifikat som redovisar de större biprodukttopparna separat säger mer än ett som bara anger ett totaltal.

Den täcker bara det som detektorn ser. Peptiddetektion sker oftast med UV vid en våglängd där peptidbindningen absorberar. Ämnen utan den absorptionen — restlösningsmedel, oorganiska salter, vatten — ger ingen topp och räknas därför varken in i täljaren eller i nämnaren.

Den säger ingenting om mängd. En hög renhetsgrad handlar om proportioner inom provet, inte om hur många milligram flaskan innehåller. De två är helt olika uppgifter.

Och den gäller ett prov vid ett tillfälle. Certifikatet beskriver batchen som den analyserades, inte hur flaskan hanterats därefter.

Renhet är inte samma sak som nettoinnehåll

Det här är den skillnad som förbises oftast, och den är stor nog att märkas.

Syntetiska peptider levereras nästan alltid som salter. Under framställning och rening binder motjoner till molekylen — trifluorättiksyra och acetat är de vanligaste — och de följer med in i den frystorkade produkten. Materialet drar dessutom åt sig en viss mängd vatten.

Följden är att flaskans totala vikt inte består av enbart peptid. En peptidsaltprodukt kan i typfallet ha en betydande andel av vikten i motjoner och restfukt även när HPLC-renheten är mycket hög, eftersom de posterna aldrig kom med i kromatogrammets areaberäkning.

Uppgiften som beskriver detta kallas nettopeptidinnehåll och bestäms med andra metoder — aminosyraanalys eller kväveanalys. Alla certifikat redovisar den inte. Att den saknas betyder inte att något är fel, men det betyder att den frågan inte är besvarad av dokumentet.

Skillnaden mellan de två talen är alltså inte en teknikalitet. Renhet svarar på hur ren peptiden är. Nettoinnehåll svarar på hur mycket peptid som finns.

Renhet och nettoinnehåll är olika svar

En hög HPLC-renhet garanterar inte ett högt nettopeptidinnehåll, eftersom motjoner som trifluoracetat eller acetat och restfukt kan utgöra en betydande del av flaskans vikt utan att synas i kromatogrammets areaberäkning. Renhet svarar på hur ren peptiden är, nettoinnehåll på hur mycket peptid som finns.

Masspektrometri: identiteten

Masspektrometern joniserar provet och mäter förhållandet mellan massa och laddning för de joner som bildas. Eftersom en peptids molekylmassa följer direkt av dess aminosyrasekvens går den teoretiska massan att räkna fram i förväg. Stämmer den uppmätta massan med den beräknade är det ett starkt stöd för att molekylen är den avsedda.

Det är kvalitativt snarare än kvantitativt. Metoden bekräftar vad något är, inte hur stor andel av flaskan det utgör. Ett certifikat som bara redovisar masspektrometri saknar därför renhetsledet, och tvärtom.

En sak till är värd att veta: massan ensam skiljer inte alltid mellan molekyler som väger lika mycket. Två sekvenser med samma aminosyrasammansättning i olika ordning har identisk massa. I praktiken är det ovanligt att det spelar roll för en definierad syntesprodukt, men det illustrerar varför metoderna kompletterar varandra i stället för att ersätta varandra.

Sterilitet och endotoxin

Vissa certifikat innehåller ytterligare paneler som besvarar helt andra frågor än identitet och renhet.

Sterilitetstest undersöker om provet innehåller odlingsbara mikroorganismer. Endotoxintest mäter förekomsten av lipopolysackarider från gramnegativa bakteriers cellvägg — ämnen som kan finnas kvar även efter att bakterierna själva avlägsnats, och som därför inte fångas av ett sterilitetstest.

De två paneler är alltså inte utbytbara: ett sterilt material kan ha endotoxinnivåer, och ett endotoxinfritt material behöver inte vara sterilt.

Att de saknas på ett certifikat betyder att just de frågorna inte har ställts för den batchen, inte att svaret skulle vara negativt. Vilka paneler som ingår framgår av rapporten, och det är en av de saker som är värd att läsa innan man jämför två certifikat med varandra.

Varför det spelar roll vem som mätte

Ett certifikat är bara så användbart som dess oberoende. En rapport beställd, utförd och formaterad av samma part som säljer produkten går inte att kontrollera utifrån, och det är inget en snygg layout kompenserar för.

Därför är laboratoriets namn en av de mest informativa uppgifterna på dokumentet. Ett laboratorium utan koppling till leverantören har ett uppdrag: att mäta. Det är också skälet till att analysmetoden anges — utan uppgift om metod går ett resultat varken att bedöma eller att jämföra mot ett annat certifikat.

Batchnumret knyter ihop det hela. Ett resultat utan batchnummer, eller med ett nummer som inte finns på flaskan, beskriver en annan tillverkningsomgång än den du har framför dig — och då spelar det ingen roll hur bra siffrorna är.

Analysdatumet hör till samma resonemang. Det talar om när mätningen gjordes, vilket är den enda tidpunkt certifikatet uttalar sig om.

Vanliga frågor om renhet och analys

Läs certifikatet för din batch

Alla publicerade rapporter är samlade och sökbara.

Öppna certifikatbiblioteket