Så tillverkas en syntetisk peptid: från harts till pulver
· Uppdaterad
En peptid byggs en aminosyra i taget på hartskulor, klipps loss, renas och frystorkas. Så går det till, och därför väger pulvret mer än peptiden.
I korthet
- Merrifield beskriver fastfassyntesen
- 1963
- Nobelpriset i kemi för metoden
- 1984
- aminosyror i tirzepatid, en i taget
- 39
Kort sagt
En peptid byggs på harts, klipps loss med syra, renas med HPLC och frystorkas, och motjonen gör att pulvret väger mer än peptiden.
Hur tillverkas peptider?
En forskningspeptid byggs kemiskt, en aminosyra i taget, medan kedjan sitter fast på små kulor av harts. När kedjan är färdig klipps den loss, renas och frystorkas till det pulver som hamnar i flaskan.
Metoden är densamma oavsett längd. GHK-Cu bygger på 3 aminosyror, BPC-157 på 15 och tirzepatid på 39. Det som skiljer är hur många varv processen går, och det påverkar allt som kommer efter. Den här texten följer de fyra stegen i tur och ordning: syntes, klyvning, rening och frystorkning.
Vad är fastfassyntes?
Fastfassyntes är metoden där peptidkedjan byggs medan den sitter förankrad vid ett fast bärarmaterial, oftast små kulor av harts. Den amerikanske kemisten Bruce Merrifield beskrev den 1963 och fick Nobelpriset i kemi för den 1984.
Kedjan byggs baklänges jämfört med hur den skrivs: från C-änden mot N-änden. Den första aminosyran fästs vid hartset, och varje ny aminosyra kommer med en skyddsgrupp som hindrar den från att reagera på fel ställe. Ett varv har tre moment: ta bort skyddet, koppla på nästa aminosyra, tvätta. Fördelen med det fasta underlaget är att överskott av reagens bara sköljs bort, medan kedjan stannar kvar.
Pulvrets vikt är inte bara peptid
Motjoner och kvarvarande vatten ingår i pulvrets vikt. Därför kan etikettens milligram och peptidens milligram skilja sig, även när renheten är hög. Renhet och nettopeptidinnehåll är två olika mått.
Varför klipps kedjan loss från hartset?
Kedjan klipps loss för att bli en fri molekyl: så länge den sitter på hartset går den varken att rena eller analysera som en egen substans. Klyvningen görs med en stark syra, i den vanligaste metoden trifluorättiksyra, förkortad TFA. Samma steg tar bort skyddsgrupperna på aminosyrornas sidokedjor.
Det som kommer ut kallas råprodukt. Den innehåller den färdiga kedjan, men också kortare kedjor från varv som misslyckades och rester av skyddsgrupperna. Hur stor del som är rätt molekyl beror på sekvensen. Begrepp som acetatsalt, aminosyrarest och nettopeptidinnehåll förklaras kort i ordlistan.
Hur renas råprodukten?
Råprodukten renas med preparativ HPLC, en storskalig variant av den kromatografi som senare mäter renheten. Vätskan pumpas genom en kolonn där molekylerna hålls kvar olika länge beroende på hur vattenavvisande de är, och de kommer ut i fraktioner vid olika tider.
Fraktionerna analyseras, och de som innehåller rätt molekyl med tillräcklig renhet slås ihop. Resten sorteras bort, vilket är skälet till att rening kostar utbyte. Kontrollen efteråt bygger på samma princip i liten skala: analytisk HPLC för renheten och masspektrometri för identiteten. Vad procentsiffran på ett certifikat faktiskt säger står i artikeln om renhet.
Från harts till flaska i fyra steg
- Syntes Kedjan byggs från C-änden, en skyddad aminosyra per varv, fast på hartskulor.
- Klyvning En stark syra, oftast TFA, lösgör kedjan och tar bort skyddsgrupperna.
- Rening Preparativ HPLC skiljer rätt molekyl från kortare kedjor och rester.
- Frystorkning Vattnet tas bort under vakuum, och kvar blir en torr kaka eller ett pulver.
Vad är en motjon, och varför TFA eller acetat?
En motjon är den negativt laddade jon som följer med varje positiv laddning på peptiden, så att pulvret blir ett neutralt salt. Efter reningen, där vätskan innehåller TFA, är motjonen oftast trifluoracetat. Ibland byts den ut mot acetat i ett extra steg, och då levereras peptiden som acetatsalt.
Motjonen väger, men den är inte peptid. En sekvens med många basiska aminosyror bär fler motjoner: TB-500, kedjan LKKTETQ, har två lysiner. Tillsammans med kvarvarande vatten är det skälet till att nettopeptidinnehållet är lägre än pulvrets vikt, även när renheten är hög. Skillnaden mellan de två måtten reds ut i guiden om renhet och analys. Hur mycket motjonerna väger i en räkning visar artikeln om molmassa och dalton.
Varför frystorkas peptiden sist?
Peptiden frystorkas sist för att vattnet från reningen ska bort utan att molekylen värms upp. Lösningen fryses och placeras i vakuum, så att isen övergår direkt till ånga. Kvar blir en torr, porös kaka eller ett pulver.
Ett torrt pulver är stabilare än en lösning och tål transport bättre, och det är därför flaskan kommer utan vätska. Färgen är oftast vit, men GHK-Cu är ett tydligt undantag: kopparkomplexet gör pulvret blått. Hur frystorkningen går till mer i detalj har vi beskrivit i artikeln om frystorkning.
En peptid byggs en aminosyra i taget på hartskulor, klipps loss, renas och frystorkas. Så går det till, och därför väger pulvret mer än peptiden.
Varför kostar en lång peptid mer att göra?
En lång peptid kostar mer eftersom inget varv i syntesen lyckas helt, och förlusterna multipliceras. Anta att varje koppling lyckas till 99 procent. En tripeptid behöver två kopplingar, och ungefär 98 procent av kedjorna blir hela. BPC-157 behöver fjorton, och andelen sjunker till ungefär 87 procent. Tirzepatid behöver trettioåtta, och då blir bara ungefär 68 procent hela.
Exemplet är förenklat, men mönstret håller. Tirzepatid bär dessutom en fettsyrakedja som ska kopplas på. Allt som blev fel måste renas bort, och det är material som redan kostat. Hur det slår igenom i priset står i artikeln om varför peptidpriser skiljer sig. Resultatet för varje batch syns i certifikatbiblioteket.
Se resultatet av hela kedjan
Varje batch har ett publicerat analyscertifikat med renhet och uppmätt massa.